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實驗收費標準:
項目編號 | 項目名稱 | 計價單位 | 單價 |
ZC1071 | 免疫熒光(雙標) | 張 | 80元 |
服務介紹:
在同一組織細胞標本上需要同時檢測兩種抗原時,需進行雙重熒光染色。雙重免疫熒光標記法(double immunofluorescence labeling method)也分為直接法和間接法。
免疫熒光(雙標)服務實驗結果展示:
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免疫熒光(雙標)服務實驗流程:
冰凍切片熒光tunel+免疫熒光雙標實驗步驟
1、 冰凍切片固定:冰凍切片從冰箱拿出來復溫,晾干水分,冷丙酮固定10min,待丙酮*干后于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
2、 修復:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止液體流走),在圈內滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K儲存液用PBS 1:9稀釋)覆蓋組織,37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
3、 破膜:切片稍甩干后在圈內滴加破膜工作液覆蓋組織,常溫下孵育20min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
4、 加試劑1,2:按片子數量和組織大小取tunel試劑盒內適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合(試劑1,2為現配現用),加到圈內覆蓋組織,切片平放于濕盒內,37℃恒溫孵育2小時,濕盒內加少量水保持濕度。
5、 BSA封閉:將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min,在圈內滴加用3%BSA均勻覆蓋組織,室溫封閉30min。
6、 加一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。(濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā))
7、 加二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min。
8、 DAPI復染細胞核:切片用PBS(PH7.4)洗滌3次,每次5min。去除PBS后在圈內滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。
9、封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
10、 鏡檢拍照:切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(紫外激發(fā)波長330-380nm,發(fā)射波長420nm;FITC綠光激發(fā)波長465-495nm,發(fā)射波長515-555 nm;CY3紅光激發(fā)波長510-560,發(fā)射波長590nm)
石蠟切片熒光tunel+免疫熒光雙標實驗步驟
1、 石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-無水乙醇Ⅰ10min-無水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗(冬天脫蠟時間稍微延長)。
2、 修復:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止液體流走),在圈內滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K儲存液用PBS 1:9稀釋)覆蓋組織,37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
3、 破膜:切片稍甩干后在圈內滴加破膜工作液覆蓋組織,常溫下孵育20min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
4、 加試劑1,2:按片子數量和組織大小取tunel試劑盒內適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合,加到圈內覆蓋組織,切片平放于濕盒內,37℃恒溫箱孵育2小時,濕盒內加少量水保持濕度。
5、 BSA封閉:將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min,在圈內滴加用3%BSA均勻覆蓋組織,室溫封閉30min。
6、 加一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。(濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā))
7、 加二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min。
8、 DAPI復染細胞核:切片用PBS(PH7.4)洗滌3次,每次5min。去除PBS后在圈內滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。
9、封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
10、 鏡檢拍照:切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(紫外激發(fā)波長330-380nm,發(fā)射波長420nm;FITC綠光激發(fā)波長465-495nm,發(fā)射波長515-555 nm;CY3紅光激發(fā)波長510-560,發(fā)射波長590nm)
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