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WB(核蛋白)檢測服務實驗收費標準:
項目編號 | 項目名稱 | 計價單位 | 單價 |
ZC1103 | WB(核蛋白、線粒體蛋白、膜蛋白) | 個 | 180元 |
服務介紹:
印跡法(Blotting)是指將樣品轉移到固相載體上,而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。Western Blot是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。
實驗結果展示:
WB(核蛋白)檢測服務注意事項
蛋白樣品制備的注意事項:
1、細胞數量達5×106
2、將細胞裂解液再離心,收集上清液,加loading煮樣5min。
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳注意事項:
1、做膠:防止漏膠、進氣泡以及花膠(水封、插梳子和拔梳子)
2、加樣:兩邊加loading,加樣量一樣,加樣時間要盡量短,以免樣品擴散。
3、電泳:將膠夾好放于電泳槽中,加電泳buffer(內外面不能聯通),將電壓調到90V開始電泳。
轉膜注意事項:
1、泡膜:轉膜之前將海綿、膠、膜都用預冷的轉移buffer浸泡20min。(1.凝膠若是沒在預冷的轉膜buffer中浸泡,就會在轉膜過程中出現凝膠皺縮,導致出現轉移條帶變形。2.PVDF膜具有疏水性,需用甲醇浸泡)
2、轉膜順序:陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板
3、轉膜條件:0.35A 250V 1h40min 冰浴中進行轉膜(具體轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定;目的蛋白的分子量越大,需要的轉膜時間越長,反之則短)
4、避免直接用手碰雜交膜,使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉膜效率并會使膜臟掉。
5、夾好膜和凝膠后,確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在,否則會導致轉膜不*。
6、保證膜和濾紙的大小和凝膠*一樣,過大和過小都會影響轉膜效率。
7、雞來源的抗體與PVDF和尼龍膜有較強的結合能力,從而產生較高的背景,故如果選擇雞來源的抗體最好使用硝酸纖維素膜(NC膜)
關于磷酸化蛋白檢測的注意事項:
1、保持待測蛋白處于磷酸化狀態!在標本提取液中加入足夠的磷酸酶抑制劑(NaF,可以防止去磷酸化),并將標本時刻保持在冰浴中!
2、使用5%的BSA作為封閉試劑!不能使用脫脂奶粉!(因為脫脂奶粉中含有酪蛋白,會出現很高的背景)。
抗體保存注意事項:
1、收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進行分裝盒保存!
2、對于大部分抗體,比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃
①分裝的量以一次實驗用完為好,最少不能少于10μl每份。因為分裝體積越小,抗體的濃度越可能會受到蒸發以及管壁吸附的影響。
② 復融后的分裝抗體如果一次用不完,將剩余母液保存在4℃,避免再凍起來!
③絕對避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。
3、大部分抗體收到后4℃短暫保存1-2周對抗體活性是沒有影響的。
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