單糖組成分析是研究多糖結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及構(gòu)效關(guān)系的基礎(chǔ)。其研究中主要包括多糖水解的方法和條件、衍生化方法和單糖檢測方法,如圖1所示。常用的水解方法主要有酸水解法和酶解法,此外還有氧化降解法、超聲降解法、輻射降解法等。由于單糖不具有紫外與熒光吸收,檢測時常將其進行衍生化處理。單糖組成常用的檢測方法一般有4種,分別是氣相色譜法 (GC)、高效液相色譜法 (HPLC)、離子色譜法 (IC) 和薄層色譜法 (TLC)。
GC法較早用于分析多糖單糖組成,方法靈敏度高,各單糖的色譜峰的分離度良好。由于單糖不具有揮發(fā)性,采用GC法測定時,常對單糖進行硅烷化或乙酸酯化處理,使其成為易揮發(fā)且對熱穩(wěn)定的衍生物。GC法只適合測定中性多糖,不適宜測定糖醛酸及N-乙酰氨基糖的檢測。GC法測定多糖的單糖組成,常用的檢測器包括氫火焰檢測器(FID)、質(zhì)譜檢測器 (MS)。
HPLC法
HPLC法是測定多糖單糖組成的常用方法之一,較GC法更適用于單糖組成較為復(fù)雜的多糖檢測。HPLC法常使用鍵合相硅膠柱(如C18柱)和氨基柱。目前基于離子交換、空間排阻、配位交換、分配吸附等多種分離原理的新型糖分析柱也日益應(yīng)用廣泛,如SugarS系列、SugarKS系列、AsahipakGS-220HQ、AsahipakNH2P系列色譜柱等。HPLC法檢測單糖時,常用檢測器主要有紫外檢測器(VWD)、熒光檢測器 (FLD)、示差折光檢測器(RID)、蒸發(fā)光散色檢測器(ELSD)、電噴霧檢測器(CAD)、電化學檢測器 (ECD)、二極管陣列檢測器(DAD),各檢測器特征比較如表1所示。根據(jù)所用檢測器的不同,可分為衍生化后測定和直接測定2種情況。一是聯(lián)用DAD、VWD或FLD時,水解后的單糖需衍生化處理才能被測定,實驗室常用的衍生試劑如1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)。此法可檢測酸性、中性和堿性多糖的單糖組成[4],但用于酮糖測定的衍生化法很少;二是聯(lián)用RID、ELSD、ECD、CAD時,可無需對單糖進行衍生化。
表:HPLC法聯(lián)用的各檢測器特征比較
IC法
IC法是一種新型液相色譜技術(shù),基于離子型化合物中的離子成分,可與離子柱表面的帶電荷基團發(fā)生可逆性交換的原理,實現(xiàn)各化合物的分離。多糖水解后可直接通過IC法測定其單糖組成。
TLC法
使用TLC法測定單糖組成時,多糖水解后無需衍生化。TLC法常用薄層板為硅膠G板和微晶纖維素板、活性炭層析柱,常用展開劑和顯色劑見圖1。TLC法有操作方便、分離快速、設(shè)備簡單等優(yōu)點,但其對單糖的分離度低,實驗條件如溫度、濕度、操作者的實驗水平等,對實驗結(jié)果的影響較大,在靈敏度和準確度上低于HPLC法,常用作定性分析。